基于濾膜上細菌直接計數法的細菌總數快速檢測
【摘要】 細菌總數快速檢測在質量監(jiān)測中具有重要的意義，目前除了經典的平板培養(yǎng)法以外，還有微菌落法、阻抗法等快速檢測方法，這些方法或者需要較長的檢測時間，或者需要較高的檢測成本。本研究提出一種不需要培養(yǎng)而在濾膜上直接計數的細菌總數的快速檢測方法，它主要分為過濾、染色、顯微鏡計數和計算四個步驟。計算細菌總數時，根據細菌在濾膜上的分布特點，對傳統(tǒng)公式進行改進，提出按區(qū)域計算細菌總數的計算方法，提高了檢測精度。研究結果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一種低成本、快速的細菌總數檢測方法。
1 引 言
細菌總數計數的研究已有很多，目前國標規(guī)定的方法為平板計數法，該方法是將樣品加入瓊脂營養(yǎng)基，在37 ℃下培養(yǎng)24～48 h后計數。這種方法精度高，但耗時長，難以滿足實際工作需要。為了簡化檢測程序、縮短檢測時間，國內外學者進行了大量的快速檢測方法的研究，提出了阻抗檢測法〔1〕、Simplate TM全平器計數法〔2〕、微菌落技術〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢測方法，取得了的成果，但檢測時間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎上，提出了在濾膜上染色后，直接計數的細菌總數檢測方法，具體步驟為：用集菌儀進行細菌收集→在膜上進行染色→在油鏡下計數→按公式計算出菌液濃度。實驗結果表明，該方法與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法無顯著性差異，檢測時間約1 h，是一種快速的細菌總數檢測方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗材料有集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司），染色劑，生物顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司），聚碳酸脂膜（直徑47 mm）。
2.2 實驗方法
2.2.1 準備工作 卸下集菌儀的濾網（見圖1），統(tǒng)計濾網上小孔總數，為計算菌液濃度做準備。另外，還需對集菌儀中的集菌器進行高壓滅菌，以防止過濾過程中引入外源細菌。
2.2.2 細菌收集 取濃度的霉菌菌液300～500 ml，裝在集菌儀上，集菌儀采用蠕動加壓方式對菌液施加的壓力，使菌液流過孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過濾方法是因為它可以使細菌相對均勻地分布在濾膜上，而選用聚碳酸脂膜是因為這種膜具有良好的透光性，便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜，切下一部分放在載玻片上，進行染色、固定。染色的目的是增大細菌與背景的對比度，便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計數與計算 菌液經集菌儀過濾后，細菌在濾膜上的分布見圖2、圖3，由圖可以看出細菌分布具有以下兩個特點：一是細菌集中在一個個的圓形區(qū)域內，這些圓形區(qū)域和擋板的小孔相對應；二是各個圓形區(qū)域之間細菌很少。根據膜上細菌分布的這種特點，提出以圓形區(qū)域為單位進行計數，統(tǒng)計出圓形區(qū)域內細菌的平均個數，從而計算出菌液中細菌總數。具體步驟如下：隨機選擇10個圓形區(qū)域，在油鏡下，調節(jié)焦距以獲得較清晰的圖像（見圖4），統(tǒng)計每個圓形區(qū)域內的細菌個數，然后按公式(1)計算出菌液的濃度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細菌的區(qū)域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細菌的區(qū)域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細菌染色后圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中：X表示待檢菌液濃度（CFU/ml）
A表示10個圓形區(qū)域內細菌總數
N表示濾網上小孔總數
V表示集菌時所用待檢菌液體積（ml）
3 結果與討論
3.1 實驗結果
按上述方法計算得到的結果與平板培養(yǎng)法得到的結果見表1。表1 兩種方法得到的細菌總數
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6染色鏡檢
(cfu/ml）185168157165171166平板培養(yǎng)
(cfu/ml)176155165158183152
對表1中兩組數據進行配對t檢驗，在α=0.05時，雙尾檢驗結果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說明兩種方法得到的結果無顯著性差異。
3.2 討論
3.2.1 計算公式的改進 用集菌儀對樣本菌液進行過濾時，由于濾網擋板的作用，使得細菌不是均勻地分布在整個濾膜上，而是集中分布在濾網的小孔處，所以，計算細菌總數時，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分別為濾膜直徑和視野直徑），該公式是微菌落方法檢測細菌總數中的常用計算公式。在本實驗中，根據細菌分布的特點，提出以圓形區(qū)域為單位計算細菌總數的思路，使計算結果更接近真實值，從而提高了檢測精度。
3.2.2 細菌大小的影響 細菌大小對本實驗的影響主要體現在鏡檢時，如果細菌太小，顯微鏡計數時不能將細菌從背景中分辨出來，我們的實驗結果顯示，不能分辨大腸桿菌和葡萄球菌，而較大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 檢測時間進一步縮短 細菌總數的經典檢測方法是平板培養(yǎng)法，得到的結果精度高，但是它所用時間長，為了縮短檢測時間，出現了微菌落法，將檢測時間縮短為4 h左右〔3-5〕。本研究不對細菌進行培養(yǎng)，而是在膜上染色后直接用顯微鏡計數，大限度地縮短了檢測時間，使整個檢測時間在1 h左右。
4 結論
本研究用集菌儀將菌液過濾后，取濾膜一部分進行染色、制片，然后在油鏡下統(tǒng)計細菌個數。根據細菌在濾膜上的分布特點，提出將圓形區(qū)域作為統(tǒng)計單位，得到圓形區(qū)域內細菌的平均個數，從而計算出菌液濃度。實驗結果表明，按照該方法得到的結果與平板培養(yǎng)法的結果無顯著性差異。與平板培養(yǎng)法和微菌落法相比，該方法不需要細菌培養(yǎng)，檢測時間只需要1 h左右，明顯縮短了檢測時間，是一種快速、有效的細菌總數檢測方法。
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